重組DNA的構(gòu)建（載體構(gòu)建）

基本原理：
    外源目的DNA與載體分子的連接稱為DNA重組，重組的DNA稱為重組體或重組子。研究中需要克隆或表達(dá)的基因?yàn)橥庠碊NA，載體是指能夠攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在其中進(jìn)行擴(kuò)增或誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的工具，其中質(zhì)粒載體最為常用。
    質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體外具有自我復(fù)制的DNA分子。所有的質(zhì)粒都有復(fù)制子、選擇性標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)3個(gè)共同的特性。質(zhì)粒載體的選擇包括載體的大小、載體拷貝數(shù)、多接頭以及篩選插入片段的能力，pcDNA3.1（+/-）是比較常用的真核表達(dá)載體。

基本步驟：
    1、目的DNA片段的獲得。這一步驟中，可以選擇通過設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增來獲得目的DNA片段，也可以通過化學(xué)合成的方法來獲得目的DNA片段，這里值得注意的點(diǎn)，目的DNA片段5'和3'端需要引物合適的酶切位點(diǎn)，方便后續(xù)與質(zhì)粒載體的連接。
    2、目的DNA片段與質(zhì)粒連接。通過選擇的酶切位點(diǎn)將環(huán)形的質(zhì)粒酶切成線性，與目的DNA片段進(jìn)行連接反應(yīng)，而后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行培養(yǎng)。
    3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定。挑選2-3個(gè)單克隆置于含有抗性的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切后電泳，能夠看到存在與目的DNA片段大小一致的條帶，說明此單克隆插入了目的DNA片段，而至于目的DNA片段中堿基序列是否存在突變點(diǎn)，需進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。只有同時(shí)滿足雙酶切鑒定大小合適并且測(cè)序后DNA堿基序列*一致的單克隆菌才被認(rèn)定為構(gòu)建成功的重組子。
    4、鑒定正確的重組質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)及保種。將上述構(gòu)建成功的重組子質(zhì)粒菌種再一次擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組子質(zhì)粒以及進(jìn)行保種，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
    值此，包含此外源DNA的重組DNA的構(gòu)建算全部完成。

注意事項(xiàng)及心得體會(huì)：
    1、目的DNA片段獲取過程中，如果選擇通過設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增方法來獲得，建議選擇高保真的酶來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，這樣在一定程度上可以降低因?yàn)閿U(kuò)增反應(yīng)而產(chǎn)生的堿基引入錯(cuò)誤。
    2、PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物盡量不要放置時(shí)間過長(zhǎng)，最好是即時(shí)進(jìn)行連接。
    3、連接體系中載體與目的基因的分子數(shù)比例，需要摸索合適的比例，一般為1:3--1:10，合適的比例能夠提高連接效率。