Western blot之蛋白轉印二三事

蛋白轉印的方法

      蛋白轉印可選擇傳統(tǒng)濕轉、半干轉或快速半干轉方法。濕轉系統(tǒng)：適用于大多數各種分子量的常規(guī)蛋白轉印。轉印過程中凝膠和膜被浸入充滿轉印緩沖液的槽中。半干轉系統(tǒng)：凝膠和膜被夾在預先潤濕緩沖液的濾紙之間，濾紙與平板電極直接接觸。半干轉系統(tǒng)的安裝使用比濕轉簡單。快速轉印系統(tǒng)：快速轉印系統(tǒng)是最近發(fā)展出來的技術，使用專用設備、專用濾紙及專用緩沖液來快速有效地轉印蛋白。通常濾紙和濕潤的膜預先放在一次性包裝中，簡化了轉印“三明治"的組裝。

轉印緩沖液

       轉印緩沖液包含強導電性化學緩沖試劑（例如Tris，CAPS或碳酸鹽），以便在轉印過程中保持系統(tǒng)的電導率和pH值。另外，轉印緩沖液中也有可能含醇（甲醇或乙醇）以促進蛋白與膜的結合，同時也可以添加SDS促進蛋白從凝膠中洗脫。

      SDS和醇：SDS和醇在轉移中起相反的作用。SDS可以促進蛋白質從凝膠中洗脫，如果某些蛋白質難以從凝膠中洗脫，則可以將SDS添加到轉印緩沖液中。但是，轉印緩沖液中的SDS會降低蛋白質與硝酸纖維素膜的結合效率；如果需要，可以使用PVDF膜作為替代。醇可從SDS-蛋白質復合物中除去SDS，并改善蛋白質與硝酸纖維素膜的結合。但是醇會導致凝膠孔徑減小，影響蛋白遷移；還會導致某些蛋白或堿性蛋白沉淀，還會使堿性蛋白帶正電荷或處于中性狀態(tài)。

         轉印緩沖液技巧：1、請勿重復使用轉印緩沖液，因為在轉印過程中緩沖液可能會失去保持穩(wěn)定pH的能力。2、不要稀釋轉印緩沖液；這也會減少緩沖能力。3、請勿調節(jié)轉移緩沖液的pH，因為這會增加緩沖液的電導率，產生較高的初始電流，降低電阻。

轉印膜的種類

      轉印膜有兩類：硝化纖維素膜（NC）和聚偏二氟乙烯 （PVDF）。

      硝化纖維素膜和增強型硝化纖維素膜：硝酸纖維素膜很容易在水或轉印緩沖液中潤濕，并且與多種蛋白檢測方法兼容。無支持的硝化纖維素很脆，不建議用于抗體剝離及重孵育實驗。增強型硝酸纖維素膜是含有惰性支撐結構的硝酸纖維素膜。這種額外的支撐使膜具有更高的強度和彈性，可以用于抗體剝離及重孵育，并可承受高壓滅菌（121℃），依然保持硝酸纖維素的易潤濕性。

      聚偏二氟乙烯 （PVDF）：PVDF 膜具有很強的蛋白結合能力（約為硝化纖維素的兩倍），并且在通常的處理中不易破裂，因此可以用于抗體的剝離和重孵育實驗。低熒光背景的 PVDF 膜結合了 PVDF 的優(yōu)勢，并且在很寬的波長范圍內具有低自發(fā)熒光。在長時間曝光情況下，不會增加背景熒光水平，有利于檢測微弱的熒光信號。

影響轉印條件的因素

      緩沖液組成：添加SDS或其他的酸、堿液會引起離子濃度變化，從而改變轉印系統(tǒng)的電阻，進而改變電流，并導致電流和電壓讀數以及轉印效率變化。

      凝膠數：電流隨著凝膠數量的增加而增加。需要考慮額外的冷卻或限制轉印時間。

      凝膠丙烯酰胺濃度：較高的丙烯酰胺百分比濃度會減慢蛋白在凝膠中的遷移。需考慮延長轉印時間。蛋白質在低濃度丙烯酰胺凝膠中遷移速度快。應考慮限制轉印時間，以防止小蛋白質轉過。

      緩沖液量：緩沖液增加時電流也會增加。需考慮額外的冷卻或限制轉印時間。

      轉印溫度：電流隨體系溫度升高而增加。

      蛋白分子量：大蛋白從凝膠中遷移的速度更慢?？紤]延長轉印時間或增加電壓。相反，小蛋白會快速遷移并可能穿透印跡膜。考慮限制轉印時間或電壓。

轉印技巧

      1、去除氣泡：均勻的蛋白質轉印需要三明治的各組件之間*接觸，尤其是凝膠和膜*接觸。氣泡會導致膜上出現(xiàn)空白點，蛋白轉印時會在氣泡周圍“流動"，因此請使用凝膠滾輪將這些氣泡趕出！提示：梯度凝膠最好上下滾動，而不是左右滾動。左右滾動會導致梯度凝膠翹曲和起皺。

      2、轉印前的預平衡：濕轉和傳統(tǒng)半干轉時，將凝膠電泳緩沖液替換為轉印緩沖液可獲得更好的轉印效果。電泳緩沖液的帶入會增加電導率，從而導致轉印過程中產生過多的熱量?？稍谒卸虝簺_洗凝膠，然后在轉印緩沖液中平衡凝膠15分鐘，平衡膜5分鐘。請注意，對于某些快速轉印系統(tǒng)，不建議使用凝膠預平衡，請遵循制造商的操作指南。

     3、防止膜變干：在轉印之前和之后均需保證膜的濕潤，從轉印三明治中取出后，轉印熱量會使膜容易變干燥。對于PVDF膜尤其重要，因為PVDF膜是疏水的。應迅速將膜浸入預先準備好的緩沖液中，以免膜干燥。如果干了，可將硝酸纖維素膜重新在緩沖液中浸濕，而PVDF膜則需要在醇中重新活化。